為什麼立體樣本總是「霧裡看花」？

傳統的寬場螢光顯微鏡（Wide-field fluorescence microscopy）會一次照亮整個立體樣本，鏡頭收進來的不只是焦平面那一層，也包含前後離焦的背景（defocus background）。結果影像如灰霧一片，細節模糊、對比度下降。

為了「只看清楚那一層」，光學切片（Optical sectioning）技術登場了。它的目的是只留下在焦訊號，去掉離焦雜訊。最常見的方法有共軛焦顯微鏡（Confocal microscopy）、構造化照明顯微術（SIM）與層光顯微鏡（Light-sheet microscopy）──它們都靠控制照明圖樣來達成切片。不過這些系統通常採用掃描方式，因此速度慢、設備大、結構複雜。

那麼，有沒有一種方法，可以像拍照片一樣「一次成像」，卻又能切片？

這，就是 HiLo顯微術。

HiLo顯微術的巧思：兩張圖的魔術融合

HiLo顯微術（High-Low frequency fusion）是一種把散斑照明（Speckle illumination）與均勻照明（Uniform illumination）融合的寬場螢光成像方法。它能不掃描，即可產生類似共軛焦顯微鏡的光學切片效果；速度更快、視野更大，還能事後調整切片厚度，特別適合動態樣本與活體觀察。

HiLo顯微術的靈感來自動態散斑照明（Dynamic speckle illumination, DSI）：把雷射打進擴散器（Diffuser），產生隨機散斑。這些斑點對比高──樣本若在焦上，影像斑點的對比度就強；若失焦，影像中每個斑點的亮暗起伏會被擴散開來，明暗差被抹平，對比度變低。也就是說，斑點的對比度本身就像一個「在焦權重圖」，可以加強焦內訊號、淡化背景。

而散斑照明的好處是，它的統計性質穩定，即使光路有散射或像差，效果也不易被破壞（圖1）。

圖 1：HiLo顯微術是一種把散斑照明與均勻照明兩張圖融合的寬視野螢光成像方法。改繪自 Chia et al., Advanced Science (2024), 11(7): 2307837，依 CC BY 4.0 授權條款使用。

從多張到兩張：HiLo顯微術的速度祕密

早期的動態散斑照明要連拍多張，估計斑點變化，速度偏慢。

HiLo顯微術的關鍵突破是「只要兩張」──在空間上分析斑點的對比度。

1.拍一張散斑照明的影像：擴散器靜止或緩動，斑點清晰、對比高。

2.拍一張均勻照明的影像：讓擴散器在單次曝光內快速擾動，斑點平均成均勻光。

這兩張影像一對一取得，再進軟體融合，就能產生 HiLo顯微術切片影像（圖2）。

圖2：(a) 均勻照明影像，(b) 散斑照明影像，樣本為標準螢光微球（直徑 25 μm），分別取自兩個軸向平面。(c) 螢光標記訊號（即焦平面區域）與背景（即離焦區域）的強度分佈曲線。

改繪自 Lin et al., Speckle illumination holographic non-scanning (SIHN) fluorescence endoscopy（2021）

為什麼「在焦」能留下來？

把散斑照明的影像(Is)與均勻照明的影像(Iu)相減，得到σI = Is − Iu。

這等於用一個會隨失焦而衰減的權重，看物體訊號：失焦越大，點擴散函數 (Point spread function, PSF）被展寬，斑點的起伏被平均，σI 趨近零。

在頻域裡再加一個高通或帶通濾波器W，讓這個「離焦衰減」更明顯。最後再把低頻在焦背景與高頻細節無縫拼起來，就得一張又薄又清晰的切片圖。

「厚或薄」我說了算：一個參數調景深

HiLo顯微術最迷人的地方是：同一對原圖，可以在後處理用單一參數σw（帶通濾波器寬度）去改切片厚度。

σw 越大 → 切片越薄（對比更高）；

σw 越小 → 切片越厚（景深更廣）。

這個彈性讓研究者可以先拍影像，再決定要「厚一點」或「薄一點」，不用重拍、不用換針孔。更棒的是，橫向解析度幾乎不受影響。

和共軛焦顯微鏡的比較

在綠色螢光蛋白（Green fluorescent protein, GFP）標記的老鼠腦組織中測試時：

寬場影像有明顯背景雜訊；

HiLo顯微術與共軛焦顯微鏡都給出高對比切片與 3D 重構能力。

用切片曲線（亮度 vs. 離焦）比較，HiLo顯微術的全寬半高值（Full width at half maximum, FWHM）只略寬於共軛焦顯微鏡。但HiLo顯微術沒有針孔、也不受球差困擾，切片更對稱。再加上非掃描架構，它能達到近視訊率的速度與大視野，是活體成像的強力選擇。

HiLo 顯微術遇上Metalens：當光學變得「聰明又薄」

傳統顯微鏡要調焦或修像差，需要厚重鏡組，近年出現的超穎透鏡（Metalens），卻讓這一切大不同。

超穎透鏡透過奈米結構在單片晶片上控制光的相位、振幅與偏振，就能完成聚焦、分色與相位校正。它比傳統透鏡薄上千倍，卻能更精準地操控光線，結構輕、解析高、穩定度也強。

而在眾多超穎透鏡設計中，莫耳超穎透鏡（Moiré metalens）是最特別的一種。它由兩片具有微細週期結構的超穎透鏡組成，當兩片稍微旋轉時，彼此間產生的莫耳干涉（Moiré pattern）會改變整體的光學相位分佈，焦距也因此隨角度變化而改變。換句話說，只要轉動角度，就能讓透鏡自動變焦──不需複雜設計馬達、不需繁瑣移動鏡片（圖3）。

圖3：可變焦莫耳超穎透鏡的設計原理：(a) 莫耳超穎透鏡的示意圖。透鏡的焦距（f_θ）可以透過改變兩片超構表面之間的相對角度來調整 (b) 為可變焦透鏡所設計的超構表面相位分佈 (c) 單元結構由氮化鎵（GaN）奈米柱組成，奈米柱高度為 800 nm（H），週期為 250 nm（P），生長在藍寶石基板上。右側為不同直徑的 GaN 奈米柱所對應的透射率與相位變化。

改繪自 Luo et al., Nano Letters (2021), 21(12): 5133-5142，原圖版權屬 American Chemical Society。

這樣的設計讓HiLo顯微術如虎添翼。HiLo 顯微術原本能用斑點在後製調景深，現在加上莫耳超穎透鏡，連光學焦點都能即時調整。從淺層組織到深層血管，只要電子控制角度，系統就能快速切換焦平面。這讓HiLo 顯微術不只是軟體「切片」，更成為真正能「變焦」的智慧光學平台。

AI 的推波助瀾：讓系統學會「自己對焦」

傳統HiLo顯微術要兩張影像；若讓AI模型學會斑點的對比與焦平面訊號的關係，就能用單張影像重建出HiLo顯微術切片效果。

透過深度學習模型（如卷積神經網路 RCNN），AI可以在短時間內預測出光學切片結果。配合莫耳超穎透鏡的可變焦機制，AI還能自動判斷最佳焦深，實現即時對焦與光學分層。

三者結合──HiLo顯微術、超穎透鏡、AI──讓光學顯微不再是笨重儀器的專利，而是一套「能思考的成像系統」（圖4）。

圖4：可變焦超穎透鏡智慧螢光內視顯微系統的示意圖

莫耳超穎透鏡被放置於系統的 傅立葉平面，用以調整焦點位置以進行三維成像。內視鏡探頭可擷取活體腦部在不同深度的螢光影像，而 RCNN 模型用於 HiLo 顯微術的演算法處理，能在單張影像下以寬場方式實現光學切片成像。

改繪自 Chia et al., Advanced Science (2024), 11(7): 2307837，依 CC BY 4.0 授權條款使用。

未來應用：從實驗室走向臨床

可變焦超穎透鏡帶來電子式對焦與高穩定性；HiLo顯微術提供高速、非掃描的光學切片；AI則讓整個過程自動化、即時化。

這套整合架構可應用於活體顯微觀察、腦部微血管追蹤、胃腸內視鏡甚至微型醫療探頭。傳統數十公斤重的顯微系統，如今有望縮小到手掌大小；影像不僅更快，也能即時三維重構。

對研究者而言，它讓動態細胞行為的觀察更輕鬆；對臨床醫師而言，它可能成為非侵入式診斷的新工具。當奈米光學與人工智慧相遇，光不再只是照亮樣本，而是成為會思考的觀察者。（本專題策畫／光電所林晃巖教授）

Reference：

[1] Daniel Lim, Thomas N. Ford, Kevin K. Chu, & Jerome Mertz. (2011). Optically sectioned in vivo imaging with speckle illumination HiLo microscopy. J. Biomed. Opt. 16(1): 016014.

[2] Yuan Luo, Chia-Hua Chu, Sunil Vyas, et al. (2021). Varifocal Metalens for Optical Sectioning Fluorescence Microscopy. Nano Letters, 21(12), 5133–5142

[3] Yu-Hsin Chia, Wei-Hao Liao, Sunil Vyas, et al. (2024). In Vivo Intelligent Fluorescence Endo-Microscopy by Varifocal Meta-Device and Deep Learning. Advanced Science, 2307837

[4] Wei-Ting Lin, Chia-Yen Lin, Vivek R. Singh, & Yuan Luo. (2021). Speckle Illumination Holographic Non-Scanning (SIHN) Fluorescence Endoscopy. Journal of Biophotonics, (https://doi.org/doi10.1002/jbio.201800010)

[5] S. A. Suresh, S. Vyas, C. H. Chu, T. Yamaguchi, T. Tanaka, J. A. Yeh, D. P. Tsai, Yuan Luo*, (2025). All-Dielectric Meta-Microlens-Array Confocal Fluorescence Microscopy. Laser & Photonics Reviews, 19, 2401314.

[6] HC Hsu, S Vyas, CH Chu, JC Wu, T Tanaka, KY Huang, HS Liao, Y Luo, et al. (2025). Metasurface-Based Airy Light-Sheet Fluorescence Microscopy. Applied Physics Reviews, 12(3).

駱遠小檔案

駱遠教授與研究團隊Optical Systems Lab（光學影像系統實驗室）同仁。

Optical Systems Lab（光學顯微影像系統實驗室）主持人駱遠教授，現任國立臺灣大學醫學院醫療器材與醫學影像研究所教授兼所長、重點科技研究學院精準健康學位學程主任，以及永齡健康研究院副院長。

先後於2007年及2008年取得美國亞利桑那大學光學科學學院碩士及博士學位，隨後在麻省理工學院（MIT）從事博士後研究（2009-2011），並於新加坡麻省理工聯盟研究中心（SMART Center）擔任訪問學者。

2011年返臺加入臺大任教，研究領域涵蓋三維立體影像與光譜成像技術、繞射光學元件設計、三維主動結構光系統及奈米光電子學，他深信光學技術在醫療領域具有無限潛力，致力於開發創新的影像技術，期望能為精準醫療與智慧醫學的發展貢獻心力，提升醫療診斷的準確性與效率。

駱教授目前亦是國際光學工程學會（SPIE）會士，並曾於新加坡麻省理工聯盟研究中心（SMART Center）擔任訪問學者。