珊瑚礁生態系在生態與經濟面皆十分重要，但日漸嚴重的氣候變遷所引發海洋暖化與酸化問題，正急速改變珊瑚生態系的功能。因此，隨著珊瑚礁保育逐漸受到重視，珊瑚礁與珊瑚共生體的研究也變得熱門。「珊瑚共生體」指的是珊瑚與其所有共生的微生物，如共生藻、細菌、真菌、病毒等。過去珊瑚共生體的研究多偏重於珊瑚的組織部位，較少探究珊瑚骨骼的區域。且過去對珊瑚骨骼的研究與應用，多偏向於利用骨骼中的化學成分來探究海洋環境的變化，卻忽略骨骼內的「微」環境，對於什麼樣的微生物會存在於此，並不清楚。

若將珊瑚骨骼剖開，可發現珊瑚骨骼並非如想像中，僅呈現碳酸鈣的白色，在較貼近組織的骨骼部位常能看到綠色條帶狀的色塊，且在不同種類珊瑚的骨骼中都可看見，只是顏色上略有不同。看到這樣的現象不免會好奇，這綠色的部位是否是為微生物造成？是什麼樣的微生物呢？為什麼有的顏色特別綠？（圖1）

圖1：同孔珊瑚團塊剖面圖。圖中咖啡色部位為珊瑚組織，組織下方為珊瑚碳酸鈣骨骼，在骨骼內有綠色條帶狀的綠層。

筆者查閱前人用顯微鏡觀察的結果發現，珊瑚骨骼的綠層是來自絲狀的藻類或藍綠菌。牠們都是使用葉綠素（chlorophyll）進行光合作用來產生碳源的自營性微生物。然而，在2007年時，一研究團隊分析了珊瑚骨骼中的蛋白成分，發現了菌綠素（bacteriochlorophyll）的存在。菌綠素與葉綠素結構相似，存在在許多光合細菌中，這也意味著，還有別的光合細菌存在。只是很可惜，當時沒有任何相關資訊。於是，引起當時在中央研究院念博士班的筆者興趣，遂以珊瑚骨骼中的細菌組成以及細菌可能扮演的功能為研究主題。儘管這是個冷門的領域。

為了釐清骨骼內的細菌組成，筆者隨指導教授的研究團隊至臺灣珊瑚研究熱點綠島進行樣本採集，我們選擇臺灣東部與南部常見的同孔珊瑚（Isopora）作為研究對象。透過電子顯微鏡觀察發現，同孔珊瑚骨骼裡單細胞的細菌數量相當多，反而前人所觀察到的絲狀結構極少，這樣的現象已經與前人所發現的有所不同了。經計數後，細胞數超過每公克1.5億個；尤其在前述所提及的綠層中，數量高達每公克2.7億個。這個數量超出了想像，原來碳酸鈣骨骼中，竟能涵養如此多的細菌。

這些細菌是誰呢？在利用次世代定序方法，揭示了這些細菌成員。他們是「綠硫菌」，一種不喜歡氧氣的光合細菌。在綠層中會高達七成以上。綠硫菌是綠菌門（Chlorobi）的俗稱，其俗名是根據這些細菌共同的外觀與功能而來的：因綠菌門的細菌多利用菌綠素進行光合作用產生能量，而菌綠素會讓這類的細菌呈現綠色或棕綠色，所以俗名中有「綠」；綠硫菌產生的能量被用來合成有機碳的過程中，不像藻類或是藍綠菌使用水當電子供應者，他們使用周遭環境中的氫或硫化氫，同時會產生硫化物在體外，也是為什麼名稱中有「硫」的原因。

接下來，從生物資訊分析總基因體的結果，也發現了珊瑚骨骼中的固氮基因主要是來自於這些綠硫菌，這結果吸引了我們的目光。怎麼說呢？因為海洋中，氮源相較於陸地來說，是匱乏的，加上自然界中能執行固氮作用的僅有少數細菌。而這些以驚人的數量存在於珊瑚骨骼中的綠硫菌有這樣的能力，暗示綠硫菌在骨骼中的氮循環代謝上有著不可忽視的角色。

只是，為了確認在珊瑚骨骼中的綠硫菌是否會執行固氮作用，讓我們吃足了苦頭。一方面綠硫菌是厭氧菌，在沒有氧氣的條件下進行實驗操作相當困難；二方面，野外的珊瑚不像觀賞珊瑚般地好培養；又加上分子生物學使用在珊瑚身上，也不像使用在模式動物般純熟，因此無法使用常見的基因表現的方法，來探究這些細菌的固氮功能。經過無數次的測試與討論，我們決定先從將珊瑚骨骼的細菌養出來這一步開始。

要養出特定的細菌，不是件容易的事。我們從台北出發，直奔綠島潛水採集同孔珊瑚樣本，需立刻放進厭氧缸中，在一天半之內要將樣本帶到具有完善厭氧操作環境的新竹食品工業發展研究所。經操作專員的指導，在絕對厭氧的條件下將骨骼取出後磨碎，再置放於綠硫菌專屬選擇性培養基中，並在不同的光照條件下培養。接著便是近一個月的漫長等待，才能曉得是否培養成功。（圖2）

 

圖2：培養出之骨骼中優勢菌綠硫菌。(a)為培養之菌液。(b)為電子顯微鏡下觀察之綠硫菌的結構，箭頭所指處為綠硫菌特徵chlorosome結構。（Yang et al. 2019）
 

運氣不錯，我們將珊瑚骨骼的綠硫菌拿到手了！綠硫菌到手固然開心，要回答問題的實驗才正要準備開始。為了知道珊瑚骨骼中的綠硫菌是否有固氮能力，我們除了採用可間接回答問題的「乙炔還原法」，也挑戰了可直接看到綠硫菌固氮表現的新方法「螢光原位雜交 - 奈米二次離子質譜技術（fluorescence in situ hybridization-Nano secondary ion mass spectroscopy，FISHNanoSIMS）」。雖然這個新方法技術門檻高，牽扯的實驗與計算又複雜，我們仍互相砥礪不斷挑戰，終於在一年後，證明了珊瑚骨骼的綠硫菌確實會固氮（圖3）。而這些綠硫菌幾乎是新種，並在海洋已知的綠硫菌群中自成一格。這表示，住在珊瑚內的這群綠硫菌，可能與珊瑚有著緊密的關係長達一段時間，以至於在演化上，足以與其他海洋綠硫菌有親緣關係的差異。但仍需日後更深入的探究才能確認。

圖3：使用FISHNanoSIMS技術證明珊瑚骨骼的綠硫菌可執行固氮作用。（Yang et al. 2019）

研究結果也透露，對骨骼內的細菌而言，光線與氧氣為兩個重要的因子。有些珊瑚骨骼質地較鬆散，能涵養的微生物是需要氧氣與光照較多的藻類或藍綠菌；有的珊瑚骨骼質地緊實，裡面的微環境呈現厭氧與微光，只能讓綠硫菌這類厭氧生物生存。換言之，珊瑚物種差異會決定細菌在珊瑚骨骼中的組成。

除了珊瑚物種會影響骨骼質地之外，外在的海水環境，像是海水的pH值，也會改變骨骼的質地。由於珊瑚骨骼主成分是碳酸鈣，當水中pH比較低，意味著水體中氫離子較多，會搶骨骼碳酸鈣的碳酸根離子，形成碳酸氫根，便會破壞珊瑚骨骼的結構。Tambutté等人在2015年時曾觀察到，珊瑚的骨骼在比海洋環境更酸的水體中一段時間，骨骼結構變鬆散，內部孔徑會變大。那是否意味著，當珊瑚骨骼環境受到外在環境影響後，裡面的微生物族群也會改變呢？

為了證實這件事，筆者於日本進行博士後研究期間，利用沖繩瀨底島海洋研究站之精密海水酸化設備，進行了一項簡單的試驗。筆者使用同孔珊瑚與微孔珊瑚兩類骨質密度不同的珊瑚，置放於酸化與非酸化的海水中，來看看珊瑚組織健康程度與骨骼中細菌組成的變化。經過兩個月的測試，發現同孔珊瑚本身不耐酸，將近一半的組織皆壞死；而微孔珊瑚彷彿不受海水酸化的影響，組織外觀健康無礙。有趣的是，骨骼密度較高的同孔珊瑚組織雖然壞死了，但骨骼內部的菌群卻不受影響；相反的，看起來健康的微孔珊瑚，骨骼中的細菌組成，已經從厭氧的細菌轉換成好氧的，表示微孔珊瑚骨質已經疏鬆了。這個結果確定了海水酸化對珊瑚骨骼的微生物族群的影響，會因珊瑚物種而異。另外也透露了件很重要的事，那就是當逆境來的時候，珊瑚骨質疏鬆這件事，是從外表看不出來的，也揭露了現行珊瑚觀測方法上的盲點。而如何解決這個盲點，正是筆者團隊正在努力的目標。

現在我們知道了，珊瑚骨骼微生物的組成，會反映珊瑚物種差異與海水環境的變化。在筆者進入臺大服務後，持續與中研院、琉球大學以及嘉義大學合作，以「珊瑚內岩生細菌族群」為系統，來探究從沖繩到東沙群島，跨季風帶地點的海水環境是否珊瑚骨骼的影響。透過這個測試，我們也觀察到，洋流中不同的物理化學與生物因子，可能都會對珊瑚骨骼內細菌的族群有著不同程度的影響。

圖4：(左)在海面下工作，拍攝珊瑚生態。
圖5：(右)採集樣品後上岸，立刻進行保存處理，分秒必爭。

 

這個「珊瑚骨骼的細菌」一系列研究，從筆者念博士班開始，直到進入臺大服務，投入了整整十年的時光。這過程百感交集，困難重重卻也成就感非凡。因為這樣的研究要接觸到的技術包羅萬象，除了實驗室裡的分子生物學與微生物學實驗，接觸生物資訊分析的程式語言，為了能在海面下工作，也得學習潛水並取得執照（圖4、圖5）。在不同團隊合作時，如何將想法與不同背景的人溝通，是學問；怎麼與人協調，是藝術。珊瑚骨骼細菌的研究始於冷門，而今成為珊瑚共生體學的不能被忽略的一塊，筆者身為該領域的前期探索者之一，亦感到十分榮幸。（本專題策畫／生命科學系鄭貽生教授兼系主任）

 

楊姍樺小檔案
中央研究院TIGP國際研究生學程/中興大學生物科技學研究所博士。現任臺大漁業科學研究所副教授。專長為微生物學、基因體學與珊瑚礁生態學。研究興趣是探討微生物在珊瑚礁環境中的變動，以及微生物在珊瑚上所扮演的角色。除了透過總基因體學一探究竟那些尚無法培養的微生物，也改良微生物分離與培養的技術，得到更多樣的海洋微生物資源。珊瑚礁生態系提供了人類重要的漁業資源，健康的珊瑚是維持珊瑚礁生態系功能的基礎，希望能透過了解微生物與珊瑚之間的關係，對珊瑚復育有更多的幫助。

 

參考文獻：
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SY Yang, CY Lu, SL Tang, R Ramen Das, K Sakai, H Yamashiro, SH Yang. 2020. Effects of Ocean Acidification on Coral Endolithic Bacterial Communities in Isopora palifera and Porites lobata. Frontiers in Marine Science 7:603293 
SH Yang, K Tandon, CY Lu, N Wada, CJ Shih, SSY Hsiao, WN Jane, TC Lee, CM Yang, CT Liu, V Denis, YT Wu, LT Wang, L Huang, DC Lee, YW Wu, H Yamashiro, SL Tang. 2019. Metagenomic, phylogenetic and functional characterization of endolithic green sulfur bacteria in the coral, Isopora palifera. Microbiome 7:3 
SH Yang, STM Lee, CR Huang, CH Tseng, PW Chiang, CP Chen, HJ Chen, SL Tang. 2016. Prevalence of potential nitrogen-fixing, green sulphur bacteria in the skeleton of reef-building coral Isopora palifera. Limnology and Oceanography 61(3): 1078-1086